目的基因

LB培養(yǎng)基

離心管 離心機 水浴鍋 漩渦振蕩儀

一、目的基因的確定

1.  檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）。

2.  NCBI查閱

3.  搜索引擎輔助

二 、設(shè)計siRNA靶序列

在制備siRNA 前都需要單獨設(shè)計siRNA序列.研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞,有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn)，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。

1.  選擇siRNA靶位點

從轉(zhuǎn)錄AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。

2.  序列同源性分析

將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人或者小鼠、大鼠等等）進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果,因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設(shè)計siRNA。

通常來說，每個目標(biāo)序列設(shè)計3-4對siRNAs，選擇有效的進行后續(xù)研究。

3.  設(shè)計陰性對照

一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當(dāng)然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。

三、表達載體的選用

1.  化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA進入細(xì)胞后容易被降解；進入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時間短.針對這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達。該方法的基本思路是：將siRNA對應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子后，這樣就能在體內(nèi)表達所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA，能達到較長時間的基因沉默效果。

2.  通過質(zhì)粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動子啟動編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列。選用Pol III啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4—5個連續(xù)的U即終止，非常。當(dāng)這種帶有Pol III 啟動子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞時，這種能表達siRNA的質(zhì)粒確實能夠下調(diào)特定基因的表達，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點在于，通過siRNA表達質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當(dāng)然還有一點，那就是由于質(zhì)粒可以復(fù)制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。

3.  帶有抗生素標(biāo)記的siRNA表達載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)粒可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達數(shù)星期甚至更久。同時RNAi-Ready表達載體還能與逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒表達系統(tǒng)整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表達載體對宿主細(xì)胞的侵染性,*克服某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙，是實現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞siRNAs瞬時表達與穩(wěn)定表 達的理想工具。

四、合成模板

1.  合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點，同時兩端分別設(shè)計 BamH I 和 Hind III 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamH I 和 Hind III 酶切位點之間。
 

2.  95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。

五、連接與轉(zhuǎn)化

1.  將100 μl感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍。

2.  取5 μl連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物，在冰上放置30分鐘。

3.  將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中，熱激90秒。快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2分鐘。

4.  每管中加700 μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，進行復(fù)蘇。

5.  室溫4 000 rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100 μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細(xì)胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細(xì)胞的效率進行調(diào)整。

6.  將平板置于室溫直至液體被吸收。

7.  倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時后可出現(xiàn)菌落。

六、PCR鑒定和測序鑒定

在插入編碼shRNA的DNA雙鏈模板兩側(cè)設(shè)計鑒定PCR引物，擴增片段在100-200，bp之間。

1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。

2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

3.  選出合適的目標(biāo)序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到有效的siRNA序列。

4.  一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有負(fù)對照，作為負(fù)對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。

如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別。因為這個突出端無需和靶序列互補。

一、siRNA操作成功要點

1. 對每個基因設(shè)計并檢測兩到四個siRNA序列

為了找到潛在靶位點，掃描靶基因中的AA序列。記錄每個AA 3’端19個核苷酸作為潛在siRNA靶位點。潛在靶位點需通過GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST分析，去除那些與其它基因明顯同源的靶位點。如果可能，siRNA應(yīng)根據(jù)mRNA低二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計。

2.  選擇低GC含量的siRNA

Ambion公司研究發(fā)現(xiàn)GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。

3.  純化體外轉(zhuǎn)錄siRNA

在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫(Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度)或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。

4.  避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品…因此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產(chǎn)品線，如除RNA酶的噴劑，拭紙及液劑，檢測和去除RNA酶。

5.  健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性

通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。

6. 避免適用抗生素

Ambion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到較好轉(zhuǎn)染效果。QIAGEN推出的專門針對RNA轉(zhuǎn)染的試劑

7.  選擇好的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA

針對靶細(xì)胞類型，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關(guān)重要。siRNA實驗要求選擇適合轉(zhuǎn)小的RNA的轉(zhuǎn)染試劑(目前大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑都針對轉(zhuǎn)染比較大的質(zhì)粒DNA，而非小的RNA分子，宿主范圍大小也不同)。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是專門針對轉(zhuǎn)siRNA優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑，是您的理想選擇。

8.  通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件

對大多數(shù)細(xì)胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞(同樣適合實驗靶siRNA)，轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細(xì)胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA。

9.  通過陰性對照siRNA排除非特異性影響

合適的陰性對照可通過打亂活性siRNA的核苷酸順序設(shè)計而得。必須注意它要進行同源比較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。

10.  通過標(biāo)記siRNA來優(yōu)化實驗

熒光標(biāo)記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實驗(配合標(biāo)記抗體)來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。